Cromatografia en Capa Fina

REVISIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS POR EL MÉTODO DE CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA.

Johanna Villarraga, Ivette Veloza, Hans Sanchez, Luisa Tobón (1)

La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia, que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía.

En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil que puede ser un gas, un líquido o un fluido super critico. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente.

Dentro de ese proceso hemos tomado varios temas para analizar en cuanto a la cuantificación de distintas sustancias a través de cromatografía en capa fina, los cuales expondremos a continuación. Identificación de aminoácidos libres en la pulpa de guayaba (Psidium guajava L.) tipo "criolla roja"

La guayaba (Psidium guajava L.) es una de las frutas tropicales más importantes, de amplio consumo en el mundo, contribuyendo con la dieta de centenares de millones de personas.

Según el estudio aproximadamente el 13% de la producción de Venezuela es para consumo fresco, el 80% va a la agroindustria para su transformación, principalmente en pulpa concentrada para obtener jugos y néctares; y en pastas de guayabas para elaborar conservas como los "bocadillos"; el 7% restante se exporta, en estado fresco a Colombia, y es transformada en pulpa concentrada y en derivados, a Holanda, Alemania, Inglaterra, Estados Unidos (Miami), Aruba y Curaçao (11).

Los aminoácidos libres influyen en las propiedades sensoriales y nutritivas del fruto. Por lo tanto el estudio busco identificar en la pulpa de un lote de 20 Kg. de guayaba (Psidium guajava L.) "criolla roja" por cromatografía bidireccional en capa fina de sílica gel 60, se seleccionó los frutos maduros para consumo fresco, y sanos. Luego se homogeneizó el casco y la pulpa central, sin semillas, en agua (en una concentración de 1:1).

Después se tamizó y centrifugó a 960 g/15 min., y el sobrenadante a 900 g/15 min. Este sobrenadante se filtró, se ajustó a pH 1,7. Después se pesó 25 ml del filtrado acondicionado por una columna Dowex 50 W x 4-200R (1,7 cm x 6 cm), activada. Se revelaron e identificaron en 10 µl del eluato, cisteína, serina, treonina, alanita y leucina. Dos de ellos esenciales. El tamaño y la intensidad de la reacción a la ninhidrina entre los aminoácidos, describen los autores que son muy similares.

Los aminoácidos libres en el metabolismo celular de los seres vivos son considerados el equilibrio entre los procesos de síntesis y degradación de las proteínas. Estos influyen en el favor de las frutas frescas y procesadas.

En éstas intervienen, en las reacciones de oscurecimiento no enzimático, que ocurren durante el almacenamiento de las mismas, en las cuales se ha identificado aminoazúcares asociados al oscurecimiento; y en las de condensación entre aminoácidos y el furfural, producto de degradación del ácido ascórbico, en medio ácido

En otro articulo se realizo un estudio de sedimentos superficiales de la Bahía Concepción, con el objeto de determinar el contenido de materia orgánica total (MOT) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP).

La Bahía Concepción esta sustentada desde la zona costera de aguas con alto contenido de nutrientes y se conoce que el aporte mas importante de la materia orgánica que se observa en la bahía esta delimitada o caracterizada por producción biológica, aporte fluvial, desechos industriales y actividad antrópica. Se estima que el 96% de MOP generada en la bahía es producido por fotosíntesis y el 50% se incorpora a los sedimentos y estos son integrados por la adsorción de compuestos orgánicos a partículas, formación de complejos y/o formación de precipitados los cuales se conocen como los mecanismos de integración. Para este estudio se conocieron diferentes puntos que aportan compuestos orgánicos en forma permanente son:

a) Actividad portuaria (i.e., puertos de Talcahuano, Lirquén, Penco y Tomé)
b) Terminales de descarga de petróleo
c) Pesca industrial y artesanal
d) Vertimiento de aguas servidas
e) Astilleros navales.

La instalación reciente de un emisario de aguas servidas en su interior, ha generado una serie de efectos sobre la fauna y/o, alteraciones en la piel de peces plano, aumento de la actividad de citocromo P450 en S. algosus y alteraciones bioquímicas en el sistema de monoxigenasas de función mixta en P. microps, C. coronatus y T. dombeii9. Los Hidrocarburos aromáticos policiclicos se conocen como sustancias persistentes, constituidas por dos o más anillos bencénicos, de baja solubilidad en agua, baja presión de vapor y con afinidad por la fracción húmica del detritus. Provienen tanto de fuentes naturales como antrópicas

Se realizó un muestreo de una transecta de cinco estaciones, en la cabeza de la bahía y una estación de referencia cercana a la boca en Noviembre del año 2000. Las muestras fueron envasadas en recipientes recubiertos con papel aluminio, rotuladas y guardadas a ?20ºC para su análisis en laboratorio. Como análisis exploratorio se realizó una cromatografía en capa fina (FIG.1), utilizando una mezcla diclorometano: n-hexano (3:7). Se utilizó como patrón, una mezcla de HAP de 2-6 anillos aromáticos. Las placas fueron comparadas cualitativamente en razón a la presencia de hidrocarburos i.e., alifáticos, aromáticos y aromáticos fluorescentes, mediante luz ultravioleta y reveladas utilizando 0,25% de K2Cr2O7 en H2SO4 y calentadas a 100ºC por 1 hora. Posteriormente, los extractos fueron analizados por cromatografía de gas asociado a masa (Hewlett Packard 5890, detector de masa selectivo HP 5972), en función de sus estructuras bases. El programa de temperatura usado: 60ºC inicial, 2 min. incremento 10ºC por min. Hasta 275ºC por 15 min. Columna HP-5 30 m, 0,25 milímetros por 0,25 micrones de tamaño de partícula. Se utilizó criseno como estándar externo en una concentración de 100 m g/ml.

Fig 1. Cromatograma de las fracciones de hidrocarburos de los sedimentos.(Eluente : n - hexano: diclorometano 7:3). El resultado de los análisis de distribución de Materia Orgánica Toxica en los sedimentos superficiales de la cabeza de Bahía Concepción, comparados con un trabajo precedente, muestran un incremento en el contenido en el Materia Orgánica Toxica en los últimos 20 años. Este aumento fue mayor en el sector Oeste de la bahía (i.e., Est. 1 y 2), y alcanzó un incremento cercano a un 10 %. El sedimento de la zona central externa de la bahía presentó un porcentaje de materia orgánica i.e., 11,78 ± 1,40. La transecta muestreada presentó sedimento del tipo fango-negro, con altos porcentajes de Materia Orgánica Toxica i.e., >12,82 ± 0,32. El mayor porcentaje fue medido en el centro de la transecta i.e., Est. 3, con 15,85 ± 0,22.

Como se observa en la siguiente tabla:

% c.v = coeficiente de variación en %. Tabla 1. Contenido de materia orgánica (%) medidos en sedimentos de seis estaciones de Bahía Concepción (n=4), Noviembre de 2000.

Los hidrocarburos poliaromáticos identificados y cuantificados por cromatografía de gas con detector de masa, en los sedimentos de Bahía Concepción.

Los cromatogramas de pireno y fluoranteno obtenidos en la estación 4. La estación de referencia (i.e., Est.6) presentó las menores concentraciones de fluoranteno y fenantreno, no se detectó concentraciones de pireno, pero sí presencia de antraceno.

Fig 1. Cromatograma de las fracciones de hidrocarburos de los sedimentos.(Eluente : n - hexano: diclorometano 7:3). La cromatografía en capa fina de los extractos de sedimento, en un análisis cualitativo de Hidrocarburos Aromáticos Policiclicos, mostró la presencia de hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos polinucleares (HAP) y compuestos polares no saponificables. Estudios previos no comunican presencia de hidrocarburos aromáticos en los sedimentos del sector del puerto de Talcahuano; sólo informan detección de alifáticos de más de 17 carbonos, en una de las estaciones cercanas al sector de los puertos de Penco y Lirquén. En conclusión de este experimento se puede decir que en los últimos 20 años ha habido un incremento en el área de distribución y en la concentración de Materia Orgánica Toxica de los sedimentos superficiales de la cabeza de la Bahía Concepción, y que las relaciones de concentración entre especies de HAP y su distribución sugiere que antraceno provendría principalmente de precursores biogénicos, fenantreno de oxidación de materia orgánica residual y aguas servidas, fluoranteno de contaminación por hidrocarburos y pireno vía fluvial generado desde incendios forestales en la región.

En otro estudio realizado en aguas se estudió la interacción del agua con materiales poliméricos sólidos. Una porción del agua adsorbida en materiales hidrofílicos esta fuertemente unida a sitios de enlace individuales (agua ligada) mientras que una cantidad adicional de agua esta unida con menos fuerza a la cadena polimérica (agua libre). Tanto el agua libre como el agua ligada han sido el tema central de muchos estudios que han encontrado, al menos en algunos casos, evidencias cualitativas de la presencia del agua directamente unida. En este articulo, se reporta un método para determinar las distintas fracciones del agua adsorbida en un material hidrofílico. Una fracción corresponde a la primera capa en contacto con el sólido absorbente y la otra fracción corresponde al resto de las capas de agua absorbida. La cuantificación fue posible evaluando los cambios en la frecuencia de vibración natural de la molécula de agua debido a su interacción con el material sólido.

Las determinaciones fueron hechas en películas de metilcelulosa acondicionadas a diferentes humedades relativas de equilibrio y usando la técnica de espectroscopía de infrarrojo, así como el método estático de microclimas. Se realizaron predicciones teóricas del agua ligada usando modelos de adsorción en multicapas y los valores experimentales de la concentración del agua ligada en función de la humedad relativa de equilibrio, fue comparada con las predicciones; con ello se determinó la factibilidad de dos modelos de adsorción utilizados en el estudio de condensación de gases en superficies sólidas.

Las muestras analizadas fueron películas de metilcelulosa acondicionadas a diferentes humedades relativas de equilibrio. Para preparar las películas, 4.25 g de metilcelulosa (Methocel A15-LV Premium, Dow Chemical, Midland, MI) se disolvieron en 75 ml de una mezcla de etanol absoluto y agua (2:1 v/v). La mezcla fue mantenida a75 °C por 20 min en agitación con reflujo. La mezcla disuelta se esparció sobre placas de vidrio (20 x 20 cm) utilizando un aplicador de cromatografía de capa fina con un espesor fijo a 1 mm.¨[34,35] y las placas fueron secadas en una estufa a 75 °C por 45 min. El espesor final fue de 22 ± 4¬, determinado por un micrómetro digital Elcometer 345 (Elcometer instruments Ltd.). Una vez secas y enfriadas, las películas se colocaron en bolsas de plástico y se almacenaron a temperatura ambiente en un desecador con sílica gel.[3639] Para acondicionar las películas a distintos valores de humedad relativa de equilibrio. Después de analizar los resultados de lo anterior se deduce que el agua correspondiente a la primera capa de adsorción en películas de metilcelulosa fue determinada por espectroscopia de infrarrojo. El cambio en la frecuencia de vibración natural del agua causada por la interacción con la matriz sólida, nos permitió distinguir la primera capa de agua del resto del agua adsorbida.

BIBLIOGRAFÍA

  • Identificación de aminoácidos libres por cromatografía de capa fina en la pulpa de guayaba (Psidium guajava L.) tipo "criolla roja". M.L. Medina1, M.A. Gallo y F. Pagano. Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA), Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2004.

  • Comportamiento y destino ambiental de la atrazina en el suelo: Deteccion por hplc y 14c de las concentraciones ambientales Bajo condiciones controladas y de campo en saldaña –Tolima1 .Cilia L. Fuentes, Amanda Lozano de Yunda, Jairo Arturo Guerrero-Dallos, Luz Elena Pérez, Israel Olarte y Baudilio Acevedo. Agronomía Colombiana, 2003.

  • Cloración del agua potable en España y cáncer de vejiga. C.M. Villanuevaa,b / M. Kogevinasa / J.O. Grimaltb. Gac Sanit 2001.

  • Cuantificación por IR del agua directamente unida a una matriz polimérica. G. Velázquez de la Cruz, M.O. Martín-Polo CICATA-IPN. José Siurob 10, Col. Alameda. Querétaro, 76040, México A. Herrera-Gómez. CINVESTAV-Qro. Libramiento Norponiente 2000, Querétaro. 76230 México. Diciembre 2000.

  • Validación de un método para la determinación de patulina en jugos y purés de frutas por HPLC. Eyda Otero Fernández-Trevejo, José Antonio Arias Verdés y Ramon Sersa Espinosa. Rev. Cubana Alimento Nutrición 2001.


1. Estudiantes Bacteriología y Laboratorio Clínico. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Grupo III-F
2.Fig 1 Cromatograma de las fracciones de hidrocarburos de los sedimentos.(Eluente : n - hexano: diclorometano 7:3
3.% c.v = coeficiente de variación en %. Tabla 1. Contenido de materia orgánica (%) medidos en sedimentos de seis estaciones de Bahía Concepción (n=4), Noviembre de 2000.
4.Fig 2 Cromatograma CG-masa correspondiente a la estación 4. Se muestra el pick de fluoranteno y pireno.